Efavirenz + emtricitabina + tenofovir 57

+

Combinación de tenofovir y emtricitabina más efavirenz: Modulación in vitro de ABC Transporter y Drogas intracelular Acumulación ▿ Laurence Bousquet 1. 2. Alain Pruvost 1. Anne-Cécile Guyot 1. Robert Farinotti 2. 3 y Aloïse Mabondzo 1. * 1 CEA, iBiTecS, Servicio de Pharmacologie et d'Immunoanalyse, Laboratoire d'Etudes du métabolisme des medicamentos, Equipe Médicaments et Neuropharmacologie, Gif sur Yvette F-91191, Francia 2 Pharmacie Clinique, EA 2706 Barrieres et pasaje de los medicamentos, Université Paris Sud, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry 92296, Francia 3 Pharmacie, Hospital Pitié-Salpêtrière, Asistencia Pública de los Hospitales de Paris, París, Francia ABSTRACTO proteínas de eflujo se ha demostrado que afecta en gran medida el uso de medicamentos retrovirales por las células y obstaculizar su acceso al sitio de replicación del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. Este estudio evaluó los factores que pueden conducir a interacciones fármaco-fármaco entre emtricitabina (FTC), tenofovir (TFV) y efavirenz (EFV), incluyendo la modulación de la expresión de proteína transportadora y la función. Se utilizaron células mononucleares de sangre periférica de voluntarios sanos para determinar si es o no una interacción entre los fármacos antirretrovirales y las células diana se produjo en cualquier combinación de FTC, TFV, EFV, FTC-TFV, TFV-EFV o FTC-TFV-EFV. Después de 20 h de tratamiento, las concentraciones de fármaco intracelular se midieron por espectrometría de masas en tandem con cromatografía líquida. funcionalidad transportador de eflujo y propiedades medicamento inhibidor se evaluó mediante la medición de flujo de salida de colorante fluorescente. expresión ABCB1 (P-glicoproteína), ABCC 1-6 (proteína asociada a la resistencia a múltiples fármacos), y OAT (transportador de aniones orgánicos) en respuesta a los tratamientos se cuantificó por semicuantitativa PCR en tiempo real. Las células tratadas con una combinación doble (FTC-TFV o TFV-EFV) o la combinación triple (FTC-TFV-EFV) producen mayores concentraciones intracelulares FTC y TFV que las células tratadas con FTC o TFV solo. Sin embargo, no se observó cambio en la concentración intracelular EFV. FTC tiende a inducir la expresión de ARNm ABCC5 y EFV tiende a inducir ABCC1 y ARNm ABCC6 expresión, mientras que TFV tendió a reducir MDR1. ABCC1. ABCC5. y la expresión de ARNm ABCC6. En estas condiciones, se observó una disminución de la funcionalidad de ABCC, y esta disminución se asoció con las acciones inhibidoras directas de estos fármacos. Este estudio in vitro muestra que el beneficio de la combinación FTC-TFV-EFV en términos de las concentraciones intracelulares de la FTC y FFV y pone de relieve los mecanismos farmacológicos que dan lugar a este efecto. La administración combinada de al menos tres fármacos virus de inmunodeficiencia anti-humano (anti-VIH) de diferentes clases de fármacos como la terapia antirretroviral de gran actividad se ha demostrado que retrasa la progresión de la enfermedad, mejorar la supervivencia, y resultar en una mejor virológica y las respuestas inmunológicas (10 ). El Panel de EE. UU. de la Sociedad Internacional del SIDA recomienda terapias de combinación que comprenden un inhibidor no nucleósido de la transcriptasa inversa (NNRTI) o un inhibidor de la proteasa potenciado con ritonavir a dosis bajas, cada uno en combinación con dos inhibidores nucleósidos de la transcriptasa reversa (INTR) o nucleótidos inhibidores de la transcriptasa (INtTI ), para el tratamiento de la infección del VIH en adultos (18). Atripla (Bristol-Myers Squibb y Gilead Sciences), que contiene el NNRTI efavirenz (EFV), la emtricitabina INTI (FTC), y el fumarato de tenofovir disoproxil INtTI (un profármaco oral de tenofovir [TFV]), es la primera vez al día régimen de única pastilla (29). La resistencia viral, una falta de adherencia al régimen de tratamiento, y factores farmacológicos pueden contribuir al fracaso del tratamiento anti-VIH. Los esfuerzos para predecir el fracaso del tratamiento se centran actualmente en la medición de las concentraciones plasmáticas de fármacos antirretrovirales (38). Sin embargo, esta no es la única variable biológica correspondiente. sistemas de eflujo de drogas de transporte, tales como P-glicoproteína (Pgp) y las proteínas asociadas a la resistencia a múltiples fármacos (MRP, o ABCCs), que se traducen en bajos niveles intracelulares de medicamentos antirretrovirales de los padres o de sus derivados activos, son de particular importancia (26). La eficacia de una terapia de combinación depende del nivel de activación de las células diana y de las interacciones de drogas que pueden limitar el acceso fármaco a los sitios diana de la replicación del VIH. ABCCs y Pgp pertenecen a la superfamilia de casete de unión a ATP (ABC) de proteínas transportadoras de membrana (20. 30). Están presentes en los linfocitos y monocitos (1. 32) y en las barreras fisiológicas (por ejemplo, la barrera sangre-cerebro [36]), en el que están implicados en el flujo de salida activo de una amplia variedad de fármacos (17). sustratos Transporte de Pgp son en su mayoría hidrófobos. sustratos ABCC están representados por aniones anfifílicos, como conjugados de compuestos lipófilos con glutatión, glucuronato, sulfato o (31). Las interacciones de los inhibidores de la proteasa con Pgp y ABCCs han sido ampliamente estudiados, y se ha demostrado que son ya sea sustratos o moduladores de transportadores de salida (9. 15. 23. 33. 42. 48. 54). Sin embargo, los datos relativos a la interacción de los NNRTI o NRTI con transportadores de salida son escasos y contradictorios (7. 9. 13. 46. 49. 50. 57). Algunos estudios indican que los NNRTI son ni sustratos de Pgp (13. 50) ni los moduladores de Pgp (7). Otros indican el potencial del tratamiento a largo plazo con EFV para inducir la expresión de Pgp en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (9) o en la línea celular LS180 (57). EFV, pero no TFV y la FTC, parece inhibir la Pgp en células MDCKII MDR1 (46. 49). Una publicación reciente que describe un estudio realizado con la línea celular LS180 mostró que la incubación a largo plazo con altas concentraciones de FTC, pero no TFV, puede aumentar la expresión de mRNA MDR1 y la función de Pgp (57). La interacción de estos fármacos con ABCCs ha sido reportado. El papel de ABCC4 en la eliminación renal de TFV se ha demostrado en ratones knock-out ABCC4 (24). En ABCC2- y células que sobreexpresan MDCKII ABCC4, Ray et al. (46) demostraron que ABCC4, pero no ABCC2, transporta TFV. También informaron de que TFV no interactúa con la acumulación de calceína ABCC2 mediada. Sin embargo, en un estudio con la misma línea celular, Weiss et al. (56) demostraron que TFV, EFV, y la FTC interactúan con ABCC1, ABCC2, y ABCC3. La interacción de TFV con los transportadores humanos de aniones orgánicos (OAT) TAOh 1 y hOAT3, dos miembros del portador de soluto (SLC) de la familia, también se ha informado en un estudio con la línea celular HEK293 transfectadas (52). In vivo, las combinaciones de TFV y lamivudina o FTC parecen proporcionar mejores respuestas virológicas (3). Un régimen de tenofovir disoproxil fumarato y EFV-FTC demuestra una durabilidad superior de la supresión de la carga viral y un mejor perfil de seguridad y morfológica más de los conseguidos con zidovudina-lamivudina y efavirenz (2. 43). Las combinaciones de fármacos orientados a lograr la sinergia entre los compuestos y reducir la probabilidad del desarrollo de resistencia a los medicamentos. El presente estudio se evaluó si y cómo las combinaciones dobles o triples de FTC, TFV, y EFV puede dar lugar a concentraciones intracelulares de drogas más altas. Se prestó especial atención a la modulación de la expresión del transportador y la función o la inhibición del transportador directa de agentes antirretrovirales. MATERIALES Y MÉTODOS Sujetos y tratamiento con células. PBMCs de donantes sanos (Etablissement Français du Sang, Rungis, Francia) fueron aislados y tratados con vehículo de control (0,2% de dimetilsulfóxido [DMSO], Sigma Aldrich, St Quentin-Fallavier, Francia) o con la Comisión Federal de Comercio (un generoso regalo de Gilead ciencias), TFV (un generoso regalo de Gilead Sciences), EFV (un generoso regalo de Bristol-Myers Squibb), solo o en combinación (5 mM cada uno), en medio RPMI 1640 (Gibco, Cergy Pontoise, Francia) suplementado con 10 % de suero bovino fetal, 2 mmol glutamina / litro, 50 mg / ml de penicilina, 50 mg / ml de estreptomicina y 100 mg / ml de neomicina (Gibco) durante 20 horas a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO 2. La cuantificación de la FTC, TFV, y EFV en PBMCs por espectrometría de masas en tandem con cromatografía líquida. Después de una 20 h de incubación con los fármacos, los analitos se extrajeron de las PBMC, las muestras, los controles de calidad y las normas, como se informó anteriormente (44). Una fracción de 40 l de la solución restante se inyectó en un espectrómetro de masas en tándem de cromatografía-líquido a alta presión, como se describe anteriormente (35), que se adaptó para FTC y detección EFV. En pocas palabras, la separación cromatográfica se consiguió en una columna Synergi Polar-RP (tamaño de partícula, 4 m; 50 por 2 mm; Phenomenex, Le Pecq, Francia) termostatizado a 40 ° C con constituido una fase móvil de ácido fórmico 0,5% y una gradiente de metanol suministrado a una velocidad de flujo de 0,3 ml / min de 2 a 80%. Detección por espectrometría de masas se realizó con un espectrómetro de masas en tándem de triple cuadrupolo (Quantum Descubrimiento) con una fuente de ionización electrospray (Thermo-Fisher Scientific) en el modo de ionización positivo para TFV y FTC y en el modo de ionización negativo para EFV. Las PBMCs en cada muestra (n = 12) se contaron mediante el uso de una prueba bioquímica validado, como se describió previamente (6). Pgp o función ABCC. Con el fin de explicar las diferencias en la cuantificación de drogas, las funcionalidades de Pgp y ABCC se evaluaron mediante la medición de flujo de salida de colorante fluorescente (0,1 mol / litro de calceína-acetoximetiléster) en presencia o ausencia de inhibidores específicos (2 M ciclosporina [Sigma Aldrich] y 30 M MK571 [Calbiochem, VWR, Fontenay-sous-Bois, Francia]) durante 30 minutos a 37 ° C. La ciclosporina en una concentración de 2 M es un inhibidor específico de Pgp (34), y MK571 es un inhibidor específico de la resistencia a los fármacos asociada-ABCC (es decir ABCCs 1, 2, y 3) (16). Después, las células se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato fría, se fijaron con fijador CellFix (01:10, 400 l, 4 ° C), y se analizaron por citometría de flujo. La fluorescencia debido a la calceína se representa como un histograma de tinción de fluorescencia en el canal 1 (FL1). función Transporter se cuantificó como se describió previamente (45) mediante el uso de la siguiente ecuación: Actividad (porcentaje) = [100 - (G significa calceína / G significa inhibidor)] x 100, en donde G significa calceína es la fluorescencia media geométrica de calceína en el muestras analizadas, y G significan inhibidor es la fluorescencia media geométrica de calceína en presencia de inhibidor. Cada experimento se realizó con PBMCs de siete donantes diferentes. la expresión de ARNm Transporter. Con el fin de explicar el efecto de la terapia antirretroviral en la funcionalidad del ABCC, llevamos a cabo más experimentos sobre la expresión del ARNm del transportador. Después de la 20-h de tratamiento antirretroviral, el flujo de salida y la afluencia de la expresión del transportador se determinó por PCR en tiempo real (n = 3). Se aisló el ARN de mamífero con un kit de ARN total GenElute (Sigma Aldrich). La concentración de ARN total y la pureza del ARN se determinaron a continuación mediante la medición de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. El / A relación A 260 280 varió de 1,8 a 2. Una muestra de 0,5 g de RNA total se convirtió en cDNA con cebadores aleatorios en un volumen total de 10 l usando un kit RT 2 de primera cadena (Superarray Bioscience Corporation, Frederick , MD). El cDNA se diluyó con agua destilada hasta un volumen de 100 l. Cada cebador en el conjunto de cebadores se usó a una concentración de 0,4 M para la RT 2 matriz específica Profiler PCR, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las placas utilizadas para el análisis fueron ABC (ABCB1. ABCC1. ABCC2. ABCC4. ABCC5. ABCC6. ABCG2) y SLC (slc22A6. Slc22A8) matrices de PCR transportador (número de catálogo CAPH-0468). Los valores relativos de expresión se calcularon como 2 - Δ CT. donde Δ C T es la diferencia en el umbral del ciclo (C T) Los valores de los genes de interés y la limpieza de genes (hipoxantina-guanina). Si el C T fue mayor que 35, se consideró que el nivel de expresión demasiado bajo para ser aplicable. efectos inhibidores directos de las drogas en la acumulación de calceína. Los experimentos para determinar los efectos inhibidores directos de los fármacos se llevaron a cabo con el fin de poner de relieve los mecanismos farmacológicos que conducen a concentraciones de fármaco intracelulares. PBMCs (5 × 10 5 células / ml) procedentes de donantes sanos (n = 6) se incubaron con el MK571 inhibidor ABCC (30 mM) como un control positivo o con diferentes concentraciones de FTC, TFV, o EFV (0,5 a 10 m, que es el rango de concentraciones solubles y no citotóxicas, como se determinó anteriormente [49]) durante 30 min a 37 ° C en 1 ml de medio completo RPMI 1640. la acumulación del fármaco se inició por la adición de calceína-AM (0,1 M por tubo 5 ml). Después de 1 h de incubación, las células se centrifugaron (500 x g. 5 min, 4 ° C), se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato fría, y después se fijaron con fijador CellFix (01:10, 400 l, 4 ° C) y se analizaron por citometría de flujo. La fluorescencia debido a la calceína se controló en el canal 1 (FL1) y se representa como un histograma de tinción FL1. El nivel de acumulación de calceína después de la incubación con calceína-AM se debe aumentar por la presencia de sustrato o un inhibidor de ABCC debido a la competencia o la inhibición de calceína-AM de flujo de salida. Estadística. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar (DE). GraphPad Prism (versión 3.0) de software (GraphPad Software, San Diego, CA) fue usado para realizar análisis estadísticos para poner de relieve las diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de datos. La significación de las diferencias entre los grupos y los controles se evaluó usando un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con post-test de Dunnett o la prueba t de Student de dos colas. Las diferencias entre las medias se consideraron significativas cuando el valor de p fue inferior a 0,05. RESULTADOS Ensayo de citotoxicidad. Ninguno de los compuestos ensayados (FTC, TFV, y EFV) ejerce efectos citotóxicos a las concentraciones utilizadas (0,5, 5 y 10 mM), tal como se evaluó con una 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio en el kit de ensayo de toxicología vitro (Sigma Aldrich) a base de bromuro. En la acumulación intracelular in vitro de fármacos antirretrovirales en PBMCs tratadas durante 20 horas in vitro. Las concentraciones de fármaco se midieron después de la 20-h de incubación con 5 M de cada fármaco. En comparación con la concentración conseguida con FTC solo, la concentración de FTC aumentó en un 42,4% ± 6,3% cuando se combinó con TFV (P = 0,0002) y 61,1% ± 13,7% cuando se combinó con TFV-EFV (P = 0,0007) ( Fig. 1A). En comparación con la concentración conseguida con TFV solo, la concentración TFV aumentó en un 30,0% ± 8,4% cuando se combinó con FTC (P = 0.004), 38,8% ± 9,4% cuando se combinó con EFV (P = 0,003), y 56,1 ± 19,1% cuando se combinó con FTC-EFV (P = 0,014) (Fig. 1B). En comparación con la concentración conseguida con EFV solo, la concentración de EFV no cambió significativamente cuando se combinó con TFV o FTC-TFV (Fig. 1C). Las concentraciones intracelulares (/ 10 6 células pmol) de FTC (A), TFV (B), o EFV (C), utilizados solos o en combinación. Los datos se expresan como medias ± desviaciones estándar (n = 12). Los valores de p (*, P 0,001) se determinaron por ANOVA con ensayo de comparación múltiple de Dunnett para la comparación post hoc de los resultados con los del control del vehículo. Efecto de las 20 h del tratamiento en función de la resistencia a múltiples fármacos transportador de linfocitos. Con el fin de explicar las diferencias observadas por cuantificación de los fármacos utilizados solos o en combinación, se investigó la función transportadora de flujo de salida después de los tratamientos con células 20-H. El porcentaje de ABCC y la actividad Pgp se evaluó mediante la medición de los efectos de los inhibidores selectivos de la Pgp y ABCCs (MK571 y ciclosporina, respectivamente) en el nivel de acumulación de calceína-AM. El porcentaje de inhibición causada por ciclosporina 30 M MK571 o 2 M se resume en la Tabla 1. Actividad relativa de ABC transporter medida por el efecto de un inhibidor selectivo (ciclosporina o MK571) en calceína-AM acumulación una La ciclosporina en una concentración de 2 mM causó ningún cambio estadísticamente significativo en el nivel de acumulación de calceína-AM en cualquiera de las células tratadas. Para todos los fármacos utilizados en combinación o solos, los descensos en la función ABCC fueron estadísticamente significativas: los valores de p fueron 0,004 para el tratamiento FTC, 0.001 para el tratamiento TFV, 0,0048 para el tratamiento EFV, 0.014 para el tratamiento FTC-TFV, 0.002 para el tratamiento TFV-EFV y 0,0001 para el tratamiento de la FTC-TFV-EFV. La expresión del ARNm de ABC y OAT transportador en respuesta a la celda de tratamiento con fármacos antirretrovirales. Después de la 20-h de incubación con un régimen antirretroviral, el nivel de expresión del ARNm transportador fue investigado por semicuantitativa en tiempo real PCR (Fig. 2). Se evaluó la expresión de MDR1. ABCC1. ABCC2. ABCC4. ABCC5. ABCC6. slc22A6. y slc22A8. que codifican Pgp, ABCC1, ABCC2, ABCC4, ABCC5, ABCC6, OAT1, y OAT3, respectivamente. Se cree que todos estos transportadores estar involucrado en el eflujo antirretroviral. Los valores de C T para la limpieza de genes (hipoxantina-guanina) no se modificaron significativamente por los tratamientos. Los niveles de expresión de Pgp (A), ABCC1 (B), ABCC5 (C), y ABCC6 (D) mRNA en PBMCs tratados con FTC, TFV, o EFV, solo o en combinación. Los datos se expresan como un gráfico de barras bajo-alto; la línea horizontal representa la media (n = 3). Tratado o células no tratadas tenían niveles muy bajos de ABCC2. ABCC4. slc22A6. y slc22A8 mRNA. Para estos genes, los valores de C T fueron mayores que 35. EFV solo a una concentración de 5 mM tendió a inducir ABCC1 y ABCC6. que codifican transportadores de salida xenobióticos. Para ABCC1. el nivel medio del ARNm se incrementó de 2,0 ± 0,6 (células de control) a 4,6 ± 0,2 (células tratadas con EFV). La relación de la media geométrica era 2,6 (Fig. 2B). Para ABCC6. el nivel medio del ARNm se incrementó de 0,3 ± 0,1 (control) a 3,2 ± 0,6 (células tratadas con EFV). La relación de la media geométrica era 1,7 (Fig. 2D). FTC solo a una concentración de 5 mM tendió a inducir ABCC5. que codifica el nucleósido / nucleótido transportador de eflujo ABCC5. La media del nivel de ARNm aumentó de 3,3 ± 1,4 (células de control) a 16,2 ± 5,6 (células tratadas con FTC) (P = 0,002). La relación de la media geométrica era 5 (Fig. 2C). Para todos los transportadores estudiados (Pgp, ABCC1, ABCC5, y ABCC6), TFV tendió a reducir el nivel de expresión mRNA. El nivel medio de Pgp ARNm se redujo de 2,5 ± 1,2 (células de control) a 0,5 ± 0,02 (células tratadas con TFV). El nivel medio ABCC1 ARNm se redujo de 2,0 ± 0,6 (células de control) a 0.45 ± 0.05 (células tratadas con TFV). El nivel medio ABCC5 ARNm se redujo de 3,3 ± 1,5 (células de control) a 0,1 ± 0,05 (células tratadas con TFV). El nivel medio ABCC6 ARNm se redujo de 0,3 ± 0,1 (células de control) a 0,1 ± 0,03 (células tratadas con TFV). Las relaciones medias geométricas fueron 0,27, 0,25, 0,05, y 0,07 para Pgp, ABCC1, ABCC5, y los niveles de ARNm ABCC6, respectivamente. efecto inhibidor directo del fármaco sobre la acumulación de calceína. Los efectos inhibidores directos de los fármacos sobre la calceína-AM de extrusión se determinaron midiendo la fluorescencia de calceína con o sin MK571, como control positivo, o diferentes dosis de FTC, TFV, y EFV (Fig. 3). ensayo de calceína evaluar el aumento dependiente de la concentración en la fluorescencia intracelular (media de la fluorescencia de calceína en unidades arbitrarias [au]) en linfocitos tratados con EFV, TFV, y FTC. El control negativo () fue 0,2% de DMSO, y el control positivo era 30 mM MK571. Los datos se expresan como media ± desviaciones estándar (n = 6). Los valores de p (*, p = NS, no significativos) se determinaron por ANOVA con ensayo de comparación múltiple de Dunnett para la comparación post hoc de los resultados con los del control del vehículo. Con 30 mM MK571, el nivel de acumulación de calceína fue 63.86% mayor que para el control. EFV aumenta el nivel intracelular de la acumulación de calceína en una forma dependiente de la concentración. EFV parecía ser el mejor inhibidor y tuvo un efecto en 10 mM similar a la de 30 mM MK571 (68,95% mayor que para el control). TFV aumentó el nivel intracelular de la acumulación de calceína a 48,89% con 10 TFV mu M (n = 6) de una manera dependiente de la concentración. FTC aumentó el nivel intracelular de la acumulación de calceína a 33,18% con 10 mM FTC (n = 6) de una manera dependiente de la concentración. DISCUSIÓN interacciones medicamentosas en pacientes que reciben terapia antirretroviral de gran actividad son causados ​​a menudo por más de un mecanismo, como una mutación en la transcriptasa inversa del VIH o proteasa; metabolismo de los fármacos, tales como por fosforilación; o la modulación de flujo de salida del transportador. Esto demuestra la importancia de conocer todos los objetivos potenciales involucrados y teniendo en cuenta su interacción compleja para la individualización de la dosis (56). Muy pocos estudios han examinado el efecto de la combinación de FTC, TFV, y EFV en sus concentraciones intracelulares y la modulación de ABC transportador de múltiples fármacos. El tratamiento con células durante 20 h produjo un aumento significativo en los niveles de la FTC y TFV cuando se utilizaron las combinaciones FTC-FFV, TFV-EFV, y la FTC-TFV-EFV en comparación con los niveles observados con cada fármaco individual. Además, las curvas de dosis-respuesta se generaron para cada fármaco en presencia de crecientes concentraciones de los otros fármacos. Hemos demostrado el aumento de las concentraciones intracelulares de TFV y la FTC al aumentar la dosis de EFV. La concentración de FTC aumentó con un aumento en la concentración de TFV y viceversa. En todos los casos, la concentración intracelular de nucleósidos alcanzó una meseta a partir de una concentración de 1 EFV M o 5 M los otros nucleósidos (datos no mostrados). Estos resultados difieren de los de Borroto-Esoda et al. (8) con respecto a la concentración TFV en PBMCs cuando TFV se combinó con FTC. Una posible explicación de esta discrepancia puede ser las diferencias en la expresión del transportador (5. 53) y los niveles de metabolitos fosforilados entre PBMCs estimuladas con fitohemaglutinina y (8) e inactivadas PBMCs interleucina-2. Probablemente debido a la muy lenta fosforilación en nuestro sistema experimental con PBMCs inactivadas, la FTC y TFV intracelular trifosforilado las concentraciones de metabolitos eran más o menos al límite inferior de cuantificación de nuestro método de ensayo utilizado para trifosfato INTI (44). En cuanto a EFV, no hubo ningún cambio en el nivel de EFV, cuando se usa solo o en combinación con los otros fármacos ensayados. Esto podría ser debido a la relación de concentración concentración intracelular / extracelular, que era muy alta en comparación con los de los otros fármacos ensayados (alrededor de 44 veces más alta), posiblemente de saturación transportadores de salida. Como alternativa, el EFV no es, posiblemente, un sustrato de Pgp o ABCC (13. 50). Con el fin de explicar las concentraciones crecientes de la FTC y TFV en terapias de combinación, se sugiere una interacción de transportadores ABC. Se investigó la Pgp y funcionalidades ABCC tras el tratamiento de 20 h con combinaciones de fármacos. Las actividades ABCC y PGP se midieron (en porcentaje) mediante la determinación de los efectos de los inhibidores selectivos de Pgp y ABCCs (MK571 y ciclosporina, respectivamente) sobre la acumulación de calceína-AM. Calceína-AM es un sustrato índice de Pgp y ABCC bien establecida (41. 55). Es un colorante fluorogénico, altamente soluble en lípidos que penetra rápidamente en la membrana plasmática. Dentro de la célula, esterasas endógenas producen la calceína colorante hidrófilo y fluorescente, que no puede salir de la célula a través de la membrana plasmática (21). Mientras que calceína-AM es un sustrato de Pgp y ABCC, calceína no lo es. La ciclosporina en una concentración de 2 M es un inhibidor específico de Pgp (34), y 30 mM MK571 es un inhibidor específico de la resistencia a los fármacos asociada-ABCC (16). El uso de una prueba de funcionalidad con un sustrato y dos inhibidores específicos, el presente estudio proporciona evidencia de una disminución significativa en la funcionalidad ABCC pero no la funcionalidad Pgp en linfocitos tratados con FTC, TFV, y EFV, solo o en combinación, durante 20 h ( Tabla 1 ). ABCC transportadores podrían desempeñar un papel en la acumulación intracelular de los fármacos. Sin embargo, no son la única causa. Por ejemplo, los tratamientos con FTC, TFV, y FTC-TFV tenían el mismo efecto en la funcionalidad ABCC, pero las concentraciones de FTC y TFV fueron mayores cuando se utilizó la terapia de combinación. Desde análogos de nucleósidos / nucleótidos son hidrófilas, una hipótesis podría ser que entran en las células por los transportistas de afluencia en lugar de por difusión pasiva. Estos transportadores de afluencia, como miembros de la familia SLC, podrían ser moduladas por las terapias de combinación de fármacos. Con el fin de investigar el efecto de la terapia antirretroviral en la funcionalidad ABCC, llevamos a cabo más experimentos sobre la expresión del ARNm del transportador y en la inhibición directa transportador de eflujo de fármacos antirretrovirales. En nuestro sistema experimental, MDR1. ABCC1. ABCC5. y los ARNm ABCC6 eran cuantificables, mientras que ABCC2. ABCC4. BCRP. OAT1. y mRNAs OAT3 no eran detectables. Los ARNm de MDR1. ABCC1. y ABCC5 se han demostrado en PBMCs (monocitos y linfocitos) (1. 26. 32). Los niveles de expresión de los otros genes eran muy bajos en nuestras condiciones experimentales. Sin embargo, nuestros resultados no podemos excluir la posibilidad de un rápido aumento en el nivel de ARNm o de la degradación de ARNm después de tratamiento con células. La funcionalidad reducida de ABCC no estaba relacionada con la disminución de expresión de ABCC1. ABCC5. o ARNm ABCC6, a excepción de TFV. Una disociación significativa entre la expresión y la actividad se ha informado (1. 12. 39. 57). Teniendo en cuenta que sólo se realizaron tres repeticiones de los experimentos, sin prueba estadística sería relevante. Incluso si tenemos que mantener la cautela debido a la pequeña cantidad de datos obtenidos para los diferentes grupos de tratamiento, pudimos observar algunas tendencias de aumentos o disminuciones en los niveles de expresión del ARNm. El análogo de nucleósido FTC tendió a inducir la expresión de mRNA ABCC5, que codifica el nucleósido y nucleótido ABCC5 transportador (22. 47. 58). EFV tendió a inducir ABCC1 y mRNA ABCC6 expresión; ambos de estos genes codifican transportadores xenobióticos (4. 11). TFV tendía a alterar los niveles de MDR1. ABCC1. ABCC5. y la expresión de ARNm ABCC6. Estos resultados sugieren diferentes mecanismos de regulación entre los transportistas. Los receptores nucleares, como el receptor constitutivo de androstano (CAR) y el receptor de pregnano X (PXR), desempeñan papeles importantes en la regulación de la transcripción y la inducción de varios genes como MDR1 y ABCC2 (27. 51). Por el contrario, sólo unos pocos estudios han evaluado ABCC1; Por otra parte, los resultados han sido polémico (28. 37). Los ABCC1 y ABCC6 promotores de genes contienen un sitio de unión Sp1-, que está implicado en la regulación de su transcripción (25. 40). El factor relacionado-p45 del factor nuclear E2 (NRF-2), un factor de transcripción para el elemento antioxidante sensible, puede ser necesaria tanto para la constitutiva y la expresión inducible de ABCC1 mRNA (19). PXR se expresa en PBMCs (1); los factores de transcripción Sp1 y NRF-2 se expresan de forma ubicua en células de mamífero. EFV Recientemente se ha demostrado para actuar como un fuerte ligando de CAR y PXR (14). están disponibles para los demás medicamentos no los datos. Las terapias de combinación no afectaron a la expresión del ARNm del transportador, probablemente debido a las compensaciones de regulación entre los diferentes fármacos. El uso de EFV solo aumentó el nivel de expresión de ARNm o ABCC1 ABCC6, pero el uso de TFV solo disminuyó ella; y el uso de las combinaciones (TFV-EFV o FTC-TFV-EFV) dio lugar a una compensación por el efecto visto con EFV o TFV solo. El mismo efecto se observó con FTC. El uso de FTC solo aumentó el nivel de expresión de ARNm de ABCC5, pero el uso de TFV solo disminuyó ella; y el uso de las combinaciones (FTC-FFV o FTC-TFV-EFV) dio lugar a una compensación por el efecto visto con FTC o TFV solo. Por supuesto, todas estas observaciones merecen confirmación. Los efectos de los fármacos sobre la función visto ABCC no fueron causadas por la modulación de la expresión de ARNm ABCC. Por lo tanto, proponemos que las drogas podrían tener un efecto directo sobre el transporte ABCC. FTC, TFV, y EFV en concentraciones que van desde 0,5 M a 10 M aumentaron los niveles de acumulación de calceína-AM de una manera dependiente de la concentración (Fig. 3), lo que sugiere la interacción de estos compuestos con los transportistas ABCC, como se ha descrito previamente (46 . 56). En conclusión, este estudio in vitro revela un beneficio del uso de la terapia de combinación, como la que se consigue con Atripla, en términos de las concentraciones de fármaco intracelular FTC y FFV. Sin embargo, siempre hay un equilibrio entre la eficacia y los efectos adversos de toxicidad /, y una buena terapia de combinación puede requerir la monitorización del paciente fármaco terapéutico. Este efecto sobre la concentración de fármaco parece ser debido en parte a una disminución de la funcionalidad ABCC y en particular a la interacción directa de los fármacos con los miembros de la familia ABCC. También proporcionamos pruebas sobre distintas vías de modulación de la expresión transcripcional entre los transportadores de salida. EXPRESIONES DE GRATITUD Agradecemos a la Agencia Nacional de Investigación sobre el Sida de apoyo financiero.